試驗(yàn)設(shè)計(jì) 抗氧化活性測(cè)定：通過測(cè)量氧自由基吸收能力（ORAC）和羥基抗氧化能力（HORAC）來評(píng)估XOS的抗氧化活性。 ? 采用人類細(xì)胞系：A549（來源于肺癌；ATCC® CCL-185TM）、HT-29（來源于結(jié)腸腺癌，ATCC® HTB-38TM）、MRC-5（正常肺成纖維細(xì)胞；ATCC® CCL-171TM）和U-937（來源于組織細(xì)胞性淋巴瘤，ATCC® CRL-1593.2TM）為研究對(duì)象，通過測(cè)定體外細(xì)胞毒性、抗腫瘤活性、細(xì)胞因子水平和谷胱甘肽水平等，評(píng)估XOS抗腫瘤活性。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）XOS的抗氧化活性 如表1所示，通過氧自由基吸收能力（ORAC）方法檢測(cè)到了體外抗氧化活性，而通過羥基抗氧化能力（HORAC）方法檢測(cè)到的抗氧化活性更低。
（2）XOS的細(xì)胞毒性和體外抗腫瘤活性 如圖1所示，與MRC-5成纖維細(xì)胞相比，XOS處理導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞系更強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用；兩種體外試驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，XOS可誘導(dǎo)時(shí)間和濃度依賴性的細(xì)胞抑制；與MTT試驗(yàn)結(jié)果相比，NR試驗(yàn)顯示出更高的細(xì)胞抑制水平，這表明溶酶體特異性的細(xì)胞毒性機(jī)制；長(zhǎng)時(shí)間使用XOS處理后HT-29和MRC-5細(xì)胞的線粒體和代謝活性降低。
如表2所示，所有腫瘤細(xì)胞類型都顯示SI高于2，證實(shí)了XOS樣品的腫瘤特異性細(xì)胞毒性作用。
如圖2所示，XOS處理的癌細(xì)胞中線粒體膜電位降低（圖2B）；JC-1染色顯示，XOS對(duì)癌細(xì)胞的影響比對(duì)ATP濃度水平的影響更敏感。
（3）XOS減少U-937細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生 如圖3所示，XOS處理并沒有激活U-937的細(xì)胞因子產(chǎn)生，在LPS存在的情況下，XOS樣品能夠在類似于抑制劑EGCG的程度上減少炎癥反應(yīng)；與在僅有LPS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞樣品相比，兩種類型的細(xì)胞因子水平都顯著降低。結(jié)果表明，XOS可以影響Toll樣受體4（TLR4）的信號(hào)通路，它介導(dǎo)了LPS激活的炎癥反應(yīng)。
（4）XOS-TLR4相互作用的分子模擬 如圖4所示，顯示了最佳對(duì)接的復(fù)合物。
如表3所示，木六糖和木五糖與TLR4的結(jié)合親和力最高，計(jì)算結(jié)果分別為-8.3 kcal/mol和-8.1 kcal/mol；木四糖的結(jié)合親和力（-7.7 kcal/mol）幾乎與木七糖（-7.6 kcal/mol）一樣；木二糖和木三糖與TLR4的對(duì)接研究顯示分別只有-6.4 kcal/mol和-6.7 kcal/mol。
如圖5所示，木六糖和木五糖與TLR4（鏈A）和核心受體骨髓分化因子-2（MD-2）的七個(gè)氨基酸殘基形成常規(guī)氫鍵（H-bonds）（圖5D，E），木七糖和木四糖與六個(gè)氨基酸殘基形成H-bonds（圖5C，F），而木二糖和木三糖與四個(gè)氨基酸殘基形成H-bonds（圖5A，B），而木四糖與氨基酸殘基ASP101以不利的鍵相互作用。
（5）XOS處理影響腫瘤細(xì)胞的谷胱甘肽平衡 如圖6所示，與在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對(duì)照組相比，XOS處理的腫瘤細(xì)胞所含的GSH水平降低，只有MRC-5細(xì)胞沒有顯示GSH濃度的差異。在XOS處理的MRC-5細(xì)胞中，氧化的谷胱甘肽形式被減少，而這種影響在XOS處理的腫瘤細(xì)胞中不明顯。相反，A549細(xì)胞在XOS存在下培養(yǎng)后，GSSG增加，GSH/GSSG的比值說明了這些效應(yīng)，甚至加強(qiáng)了這些效應(yīng)。所有用XOS處理的腫瘤細(xì)胞類型都有GSH/GSSG比值的降低，但MRC-5成纖維細(xì)胞顯示出相反的結(jié)果。
如圖7所示，顯示了最佳對(duì)接復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。
如圖8所示，就傳統(tǒng)的氫鍵而言，XOS與人類谷胱甘肽還原酶形成了強(qiáng)而穩(wěn)定的結(jié)合，XOS在4（木二糖）和11（木六糖）之間形成常規(guī)氫鍵。木三糖、木四糖、木五糖、木六糖和木七糖與一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基以不利的鍵相互作用；木六糖和木七糖與谷胱甘肽還原酶形成的常規(guī)氫鍵和碳?xì)滏I數(shù)量最多，表明與該蛋白有很強(qiáng)的相互作用能力。測(cè)試的低聚糖樣品主要包含DP為6的XOS和DP更高的XOS（7），對(duì)接分析顯示它們是谷胱甘肽還原酶的最佳結(jié)合物。
試驗(yàn)結(jié)論 本文研究了市售玉米芯來源的XOS的抗氧化活性和抗腫瘤活性，抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，XOS具有顯著的抗氧化活性。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示，XOS對(duì)來自非腫瘤組織的MRC-5細(xì)胞影響較小，但三個(gè)測(cè)試的腫瘤細(xì)胞系顯示出時(shí)間和濃度依賴性的抑制作用，XOS通過調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)和細(xì)胞氧化還原狀態(tài)來發(fā)揮其抗腫瘤作用，而細(xì)胞氧化還原狀態(tài)又受到谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)的影響。以上結(jié)果表明，XOS的這些重要的生物學(xué)特性可以被用來開發(fā)更好的抗癌療法和功能食品。 參考資料： Batsalova T, Georgiev Y, Moten D, et al. Natural xylooligosaccharides exert antitumor activity via modulation of cellular antioxidant state and TLR4[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(18): 10430. |
