試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇48只雄性Wistar大鼠（6周齡，200-250克），大鼠被單獨(dú)安置在標(biāo)準(zhǔn)的籠子里，在12/12的光照/黑暗循環(huán)室內(nèi)，溫度控制在25℃，適應(yīng)1周后，所有大鼠被隨機(jī)分為兩組，分別飼喂正常飲食（ND）或高脂飲食（HFD）24周；ND的脂肪能量為19.77%，而HFD的脂肪能量增加到59.28%；第13周時(shí)，各組隨機(jī)分為4個(gè)亞組進(jìn)行特殊處理，每個(gè)亞組的大鼠（n=6/亞組）通過(guò)灌胃管口服載體（PBS；1 mL/d）、益生菌（L. paracasei HII01 1×108 CFU/mL/d；1 mL/d）、益生元（10% XOS；1 mL/d）或合生元（益生菌和益生元1：1的組合；2 mL/d），再持續(xù)12周；分別在第0、12和24周采集血樣，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行安樂(lè)死之前，給每只大鼠注射鈣黃素溶液（10毫克/千克）兩次（即間隔6天），收集下頜骨并通過(guò)骨組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析（見(jiàn)圖1中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖）。
代謝參數(shù)和全身炎癥的測(cè)定：在基線、第12周和第24周記錄代謝參數(shù)，其中包括體重、內(nèi)臟脂肪重量、血漿脂質(zhì)概況、血漿葡萄糖和血漿胰島素水平，且在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在從尾靜脈采集血液之前，大鼠饑餓了至少5小時(shí)。對(duì)于胰島素敏感性，在研究的第24周的第一天進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT），大鼠禁食12小時(shí)，在用灌胃管口服葡萄糖（2克/公斤體重）前采血，并在喂食葡萄糖0、15、30、60和120分鐘后及時(shí)采血，進(jìn)行上述葡萄糖分析，并對(duì)血清脂多糖（LPS）水平進(jìn)行量化，以表明代謝性內(nèi)毒素血癥或系統(tǒng)性炎癥。 胰島素抵抗評(píng)估：胰島素抵抗是通過(guò)平衡模型評(píng)估（HOMA）確定的，HOMA指數(shù)由以下公式計(jì)算，HOMA指數(shù)越高，表明胰島素抵抗水平越高。
骨組織形態(tài)學(xué)微結(jié)構(gòu)分析：將沒(méi)有粘附結(jié)締組織的右半頜骨在70、95和100% v/v系列的乙醇中各浸泡3天。然后，將脫水的骨骼樣本安裝在甲基丙烯酸甲酯樹(shù)脂中。用裝有碳化鎢刀片的旋轉(zhuǎn)切片機(jī)對(duì)樹(shù)脂包埋的骨骼進(jìn)行切割，厚度分別為7 μm和12 μm，用于靜態(tài)和動(dòng)態(tài)研究；然后將骨片安裝和處理，以便在顯微鏡下觀察；下頜骨的具體關(guān)注區(qū)域來(lái)自第二臼齒區(qū)的正面切片。靜態(tài)組織形態(tài)學(xué)評(píng)估：在早期指定的下第二磨牙的齒間區(qū)域，對(duì)7微米的切片進(jìn)行Goldner三色染色處理，并在光學(xué)顯微鏡下觀察（圖2）。對(duì)于動(dòng)態(tài)組織形態(tài)測(cè)量技術(shù)，使用12微米的未染色切片，在光/熒光顯微鏡下觀察鈣黃素標(biāo)記的雙線，獲得的參數(shù)包括礦物附著率（MAR，μm/day）和骨形成率（BFR，μm3 μm-2 day-1）。
試驗(yàn)結(jié)果 （1）益生菌L. paracasei HII01、益生元XOS和合生元處理減輕了肥胖-胰島素抵抗和全身性炎癥 由表1可知，HFD喂養(yǎng)的大鼠在12周的飲食挑戰(zhàn)后變?yōu)榉逝?/span>-胰島素抵抗，這表現(xiàn)為體重和血漿脂質(zhì)的升高。觀察到血漿胰島素的增加，而血漿葡萄糖水平?jīng)]有任何顯著的差異；通過(guò)血清LPS水平的升高，觀察到HFD組發(fā)生了"代謝性內(nèi)毒素血癥"。
由表2可知，在第24周，載體處理的HFD組繼續(xù)出現(xiàn)肥胖-胰島素抵抗，并顯示出代謝性內(nèi)毒素血癥的證據(jù)；與載體處理的HFD（HFV）組相比，用益生菌L. paracasei HII01、益生元XOS和合生元干預(yù)12周后，體重、內(nèi)臟脂肪、血漿膽固醇、血漿胰島素水平、HOMA指數(shù)和OGTT曲線下面積基本上都有所下降，這些發(fā)現(xiàn)表明，所有的生物制劑處理都同樣地降低了肥胖-胰島素抵抗和系統(tǒng)性炎癥。
（2）益生菌、益生元和合生元增強(qiáng)了下頜骨骨小梁的厚度 如圖3所示，從靜態(tài)骨組織形態(tài)學(xué)來(lái)看，高脂飲食24周導(dǎo)致下頜骨骨小梁厚度減少，而骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁分離度或骨小梁數(shù)量無(wú)顯著變化，且所有的生物補(bǔ)充劑都能恢復(fù)HFD喂養(yǎng)大鼠的骨小梁厚度。
（3）補(bǔ)充益生菌、益生元和合生元后，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收降低 如圖4a所示，24周后兩種飲食之間的成骨細(xì)胞表面無(wú)顯著差異；圖4b顯示，與ND大鼠相比，HFV組的破骨細(xì)胞表面明顯增加；圖4c顯示，在HFD喂養(yǎng)的大鼠頜骨中，代表破骨細(xì)胞的蛋白溶解活性的持續(xù)活性侵蝕面也在擴(kuò)大；圖4b和圖4c顯示，與載體處理的HFD大鼠相比，用益生菌、益生元和合生元處理的大鼠顯示了較低的破骨細(xì)胞和活性侵蝕面。這些發(fā)現(xiàn)表明，在HFD喂養(yǎng)的大鼠中，所有的處理都同樣減少了破骨細(xì)胞介導(dǎo)的頜骨骨吸收，但對(duì)成骨細(xì)胞相關(guān)的靜態(tài)骨組織形態(tài)無(wú)顯著影響。
（4）益生菌、益生元和合生元恢復(fù)了HFD喂養(yǎng)大鼠的礦物質(zhì)附著和骨形成率 如圖5a所示，用鈣黃素標(biāo)記的雙綠色熒光線代表新的礦化區(qū)，表明食用HFD 24周后，頜骨的礦化附著率和按骨面歸一化的骨形成率顯著下降，證明HFD確實(shí)損害了骨形成，盡管成骨細(xì)胞表面沒(méi)有變化；圖5b和圖5c顯示，在HFD喂養(yǎng)組，所有的處理都顯著增加了這兩個(gè)動(dòng)態(tài)參數(shù)。
試驗(yàn)結(jié)論 本研究通過(guò)骨組織形態(tài)分析證實(shí)了益生菌L. paracasei HII01、益生元XOS以及它們的組合（一種合生元）對(duì)大鼠頜骨微結(jié)構(gòu)的影響，以及對(duì)HFD誘導(dǎo)的肥胖-胰島素抵抗大鼠代謝和炎癥的影響，結(jié)果表明，每日口服益生菌L.paracasei HII01、益生元XOS或兩者作為合生元，持續(xù)12周，對(duì)減輕肥胖-胰島素抵抗和減少系統(tǒng)性炎癥有相同的影響，并對(duì)改善HFD喂養(yǎng)大鼠的頜骨微結(jié)構(gòu)有類(lèi)似的潛在積極作用。 參考資料： Eaimworawuthikul, S., Tunapong, W., Chunchai, T. et al. Altered gut microbiota ameliorates bone pathology in the mandible of obese–insulin-resistant rats. Eur J Nutr 59, 1453– 1462 (2020). |
