試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用雄性Wistar大鼠作為試驗(yàn)研究對(duì)象，XOS純度為95%，從玉米芯分離得到。將大鼠隨機(jī)分為4組，HFD組（高脂飲食組，60%的能量來自脂肪）、HFD+XOS組（補(bǔ)充0.05 g/kg XOS的HFD組）、LFD組（對(duì)照組=低脂飲食組，10%的能量來自脂肪）和LFD+XOS組（補(bǔ)充0.05 g/kg XOS的LFD組），每組10只，干預(yù)12周。干預(yù)結(jié)束，安樂死，尸體剖檢前用電子秤測(cè)定體重。 在尸檢時(shí)，切除肝臟，用電子秤稱重，肝臟脂肪含量通過生化和組織學(xué)方法測(cè)定的；收集盲腸內(nèi)容物，用液氮快速冷凍并儲(chǔ)存在-80°C，從盲腸內(nèi)容物中提取細(xì)菌DNA，進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序；收集附睪、腸系膜和皮下脂肪組織、肝臟和腓腸肌，用液氮快速冷凍并儲(chǔ)存在-80°C，在冰冷的裂解緩沖液中進(jìn)一步勻化組織，提取總蛋白，測(cè)定代謝酶活性，進(jìn)行磷酸化蛋白的免疫印跡分析；從附睪和腸系膜脂肪組織以及肝臟中提取總RNA，通過定量實(shí)時(shí)PCR分析分析肝臟miRNAs和Actb mRNA以及脂肪組織Cd45 mRNA的表達(dá)水平；組織學(xué)分析的附睪脂肪組織樣本，計(jì)算每只動(dòng)物每個(gè)組織切片（切片面積25 ~ 35 mm2）中CLS的總數(shù)。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）雙向聚類 如表1所示，雙向聚類確定了五組共同出現(xiàn)的代謝物和細(xì)菌屬，與HFD組相比，HFD+XOS組大鼠糞便甘氨酸增加，次黃嘌呤、異戊酸、支鏈氨基酸和芳香族氨基酸減少，且補(bǔ)充XOS降低了與脂肪組織炎癥和代謝功能障礙有關(guān)的菌屬總豐度。
如圖1a所示，在代謝物和SCFA雙向聚類之間觀察到最強(qiáng)的正相關(guān)，SCFA雙簇中代謝物與異戊酸雙向聚類中屬的負(fù)相關(guān)最強(qiáng)，異戊酸雙向聚類中含有大多數(shù)與HFD相關(guān)的屬，這些菌屬和代謝物聚集在一起，表明雙向聚類確實(shí)反映了生物學(xué)意義；如圖1b所示，高豐度的SCFAs、糖酵解標(biāo)記物和“瘦”型微生物不僅與更瘦的表型和“更健康”的飲食有關(guān)，而且就脂肪含量而言，也與更好的肝臟健康有關(guān)。  （2）飲食對(duì)肝臟MicroRNA的影響 如圖2所示，與HFD組相比，HFD+XOS組的miR-192-5p（p=0.002）和miR-221-3p（p<0.001）的肝臟水平較低，而LFD組的miR-21-5p（p<0.001）的水平較高，同時(shí)miR-192-5p（p=0.001）和miR-221-3p（p<0.001）的水平也下降；與LFD組相比，LFD+XOS組降低了肝臟的miR-192-5p水平（p<0.001）；與HFD+XOS相比，LFD+XOS組有更高的miR-21-5p水平和更低的miR-192-5p水平（兩者的p<0.001）。
（3）飲食對(duì)肝臟中胰島素信號(hào)的磷酸化和脂肪酸氧化相關(guān)蛋白的影響 如圖3所示，在HFD中，補(bǔ)充XOS降低了ACC磷酸化，而在LFD中則增加，HFD組的ACC磷酸化低于LFD組，脂肪和XOS對(duì)ACC磷酸化有交互影響（F（1，0.012）=13.7，P=0.001）；膳食脂肪（F（1，2.8×10-5）=6.8，p=0.013），而不是XOS，影響胰島素受體底物1的抑制性Ser636/639磷酸化（p-IRS1），LFD組的磷酸化水平略低，膳食脂肪和XOS對(duì)pIRS1有交互影響（F（1，2.1×10-5）=5.7，p=0.022）；XOS影響蛋白激酶B（p-AKT）的Thr308磷酸化（F（1，4.7×10-6）=4.5，p=0.040），不依賴膳食脂肪的情況下使其略有提高；膳食脂肪（F（1，0.006）=12.0，p=0.001），而不是XOS，影響細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）的Thr202/Tyr204的磷酸化水平，且LFD組的磷酸化水平較低。
（4）飲食對(duì)脂肪組織炎癥標(biāo)志物的影響 如圖4所示，根據(jù)附睪脂肪組織的組織病理學(xué)評(píng)分，膳食脂肪（F（1，140.237）=29.2，p＜0.001）和XOS（F（1，28.463）=5.9，p=0.020）都減少了CLS的數(shù)量；在附睪（CD45-epi）（F（1，0.011）=18.1，p＜0.001）和腸系膜（CD45-mese）（F（1，0.071）=15.1，p＜0.001）脂肪組織中，LFD組的CD45 mRNA水平都高于HFD組；如圖中所示的p值所示，在HFD上，XOS有減少CD45 mRNA的趨勢(shì)。
（5）飲食對(duì)附睪和皮下脂肪組織中胰島素信號(hào)的磷酸化、脂肪酸氧化和脂肪分解相關(guān)蛋白質(zhì)的影響 如圖5所示，在附睪脂肪組織中，膳食脂肪降低了（F（1，0.73）=24.5，p＜0.001）p-ACC；膳食脂肪降低（F（1，0.09）=6.2，p=0.017）而XOS增加（F（1，0.051）=3.5，p=0.070）激活激素敏感脂肪酶的Ser660磷酸化（p-HSL）；XOS輕微地增加了p-AKT（F（1，0.054）=6.9，p=0.012）；在皮下脂肪組織中，LFD對(duì)p-ACC（F（1，0.151）=14.2，p=0.001）有增加的影響，但XOS對(duì)其沒有影響，且沒有發(fā)現(xiàn)飲食對(duì)AKT或ERK磷酸化的影響。
（6）飲食對(duì)代謝酶活性的影響 如圖6所示，LFD增加了附睪脂肪組織中AST的活性（F（1，0.002）=8.7，p=0.006），而XOS降低了腸系膜脂肪組織中AST的活性（F（1，0.411）=7.9，p=0.009）；膳食脂肪和XOS對(duì)皮下脂肪組織中AST的活性有交互影響（F（1，0.01）=12.4，p=0.001）；補(bǔ)充XOS增加了附睪脂肪組織中ALT的活性（F（1，0.006）=4.7，p=0.018），且與膳食脂肪無關(guān)；在腸系膜脂肪組織中，膳食脂肪和XOS對(duì)β-HAD的活性存在交互作用（F（1,9.333）=14.5，p=0.001），而在皮下脂肪組織中，只有膳食脂肪對(duì)β-HAD的活性有增加作用（F（1，0.027）=4.7，p=0.037）；LFD增加了附睪脂肪組織中CS的活性（F（1，0.024）=17.2，p＜0.001），而在腓腸肌中，膳食脂肪和XOS對(duì)其活性有交互影響（F（1，6.649）=4.7，p=0.037）。
（7）雙向聚類與生物標(biāo)志物之間的相關(guān)性 如圖7所示，最明顯的是miR-221-3p、miR-192-5p、肝臟甘油三酯、CLS以及少量的p-IRS1-肝臟和p-ERK-肝臟與SCFAs、碳水化合物代謝標(biāo)志物（所有P<0.05）和SCFA雙向聚類中的“瘦型”屬呈（所有P<0.05）負(fù)相關(guān)，這些生物標(biāo)志物與產(chǎn)物雙向聚類中的代謝物和屬群以及異戊酸酯雙向聚類中的屬群呈正相關(guān)；相反，p-ACC-liver、CS-epidymal、AST-mesenteric、CD45和miR-21-5p與SCFA雙向聚類中的特征呈正相關(guān)，與產(chǎn)物雙向聚類中的特征和異戊酸酯雙向聚類中的屬呈負(fù)相關(guān)（所有P<0.05），沒有一個(gè)生物標(biāo)志物與TMA雙向聚類中的代謝物總豐度明顯相關(guān)，然而，AST-皮下、miR-215p和AST-附睪與TMA雙向聚類的屬呈負(fù)相關(guān)，而CLSs與TMA呈正相關(guān)（所有的P<0.05）；異戊酸酯雙向聚類中代謝物的總豐度與p-HSL-附睪、p-AKT-附睪和p-ACC-附睪呈負(fù)相關(guān)（均為p＜0.05），與HFD+XOS組相比，HFD組的異戊酸鹽顯著升高，與肝臟甘油三酯、CLSs、miR-221-3p和miR-192-5p呈正相關(guān)（所有P＜0.05），異戊酸鹽還與miR-21-5p、p-ACC-肝臟、CD45epidymal、CS-epidymal、p-ACC-epidymal和p-AKT-epidymal呈負(fù)相關(guān)（所有的p<0.05）。
如圖8所示，兩組沿第一主成分有明顯的差異，包含總方差的20.5%，這一變異的大部分是由miR-192-5p、miR-221-3p、AA雙簇、異戊酸雙簇、p-AKT-腎上腺、p-ERK-肝臟和p-HSL-肝臟解釋的；AA和異戊酸酯雙向聚類中的總代謝物豐度與miR-192-5p、miR-221-3p呈正相關(guān)，與AST-腸系膜、CLSs和肝臟甘油三酯有較少的關(guān)聯(lián)，相反，它們與p-ERK-肝臟和p-HSL-附睪負(fù)相關(guān)，在AA雙向聚類中的屬傾向于與CLSs和肝臟甘油三酯共同變化。
如圖9所示，在顯著不同特征的PCA中，沿著解釋總方差的31.4%觀察到組別分離，甲胺與肝臟miRNAs和AST-mesenteric有強(qiáng)烈的正向變化，與pATK-epidymal和ALT-epidymal有負(fù)向變化；次黃嘌呤與CLSs、肝臟甘油三酯和p-AKT-epidymal共同變化；BCAAs（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）和芳香族氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸）與甘油三酯沿第一成分聚集，這解釋了大部分組間變化，而甘氨酸與ALT-epidymal明顯沿第二成分共同變化。
如圖10所示，Oscillibacter、Bilophila和Ruminiclostridium5屬，XOS干預(yù)后顯著減少，也與肝臟甘油三酯和miRNAs有關(guān)；Escherichia-Shigella和Marvinbryantia在補(bǔ)充XOS后增加，并與p-AKT-epidymal共變，與CLSs、肝臟甘油三酯和miRNAs負(fù)相關(guān)。
試驗(yàn)結(jié)論 總之，本文研究了XOS對(duì)高脂飲食引起的大鼠肝臟脂肪變性的影響，補(bǔ)充XOS可使高脂飲食大鼠糞便中甘氨酸增加，次黃嘌呤、異戊酸、支鏈氨基酸和芳香族氨基酸減少，同時(shí)降低與脂肪組織炎癥和代謝功能障礙有關(guān)的菌屬總豐度。從附睪脂肪組織中CLSs的數(shù)量減少可以看出，XOS對(duì)肝脂肪變性的預(yù)防作用可能與脂肪組織炎癥的減少有關(guān)，且伴隨著肝臟和附睪脂肪組織中AKT磷酸化的增加，表明炎癥減少與胰島素信號(hào)的改善有關(guān)。以上結(jié)果表明，XOS對(duì)肝臟脂肪變性的預(yù)防作用與脂肪組織炎癥的減少、胰島素信號(hào)的改善以及某些共同出現(xiàn)的糞便代謝物和細(xì)菌屬簇有關(guān)。 參考資料： Jukka Hintikka, Sanna Lensu, Elina M?kinen, et al. Xylo-Oligosaccharides in Prevention of Hepatic Steatosis and Adipose Tissue Inflammation: Associating Taxonomic and Metabolomic Patterns in Fecal Microbiomes with Biclustering[J].International journal of environmental research and public health, 2021, Vol.18(8):4049. |
