 試驗設(shè)計 選擇48只6周齡、體重為200-250克的雄性Wistar大鼠，大鼠被單獨安置在標(biāo)準(zhǔn)的籠子里，在12/12的黑暗/光照循環(huán)室內(nèi)，溫度控制在25℃，指定的食物和反滲透飲用水的供應(yīng)不受限制；適應(yīng)1周后，基線采血，所有大鼠被隨機(jī)分為兩組，正常飲食組（ND）和高脂飲食組（HFD）；ND組大鼠飼喂標(biāo)準(zhǔn)實驗室飼料，ND組大鼠飼喂標(biāo)準(zhǔn)實驗室飼料，其中19.77%的能量來自脂肪；HFD被制成球形，其中59.28%的能量來自脂肪。在整個實驗過程中，大鼠被飼喂指定的飲食24周；以前的研究表明，大鼠在12周的高脂飲食刺激后會誘發(fā)肥胖-胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，因此在第12周采集血液，以確認(rèn)肥胖-胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)；第13周，各組大鼠分為4個亞組（n=6/亞組）以接受特定的治療。大鼠每天通過灌胃管口服載體（磷酸鹽緩沖鹽水，V）、益生菌（副干酪乳桿菌HII01 1×108 CFU/mL/天，PO）、益生元（10% XOS，PE）或合生元（益生菌和益生元1：1的組合，C），再持續(xù)12周，在第24周結(jié)束時采血并進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）。安樂死前7天和1天（即間隔6天），鈣黃素溶液皮下注射到每只大鼠（10 mg/kg）進(jìn)行動態(tài)骨組織形態(tài)分析。實驗結(jié)束后，對大鼠進(jìn)行深度麻醉，并斷頭處死，收集脛骨并進(jìn)行骨組織形態(tài)學(xué)分析（見圖1中的實驗方案示意圖）。
代謝參數(shù)分析：每周記錄所有大鼠的體重（BW），在研究結(jié)束時，將大鼠處死后立即對內(nèi)臟脂肪進(jìn)行稱重；禁食至少5小時后，從尾部側(cè)靜脈采集血液（在第0、12、24周），裝入EDTA微離心管；在6000 rpm，4℃下離心10分鐘，分離血漿，將所有的試管在-80℃下冷凍保存，直到進(jìn)行生化分析；檢測血漿葡萄糖、甘油三酯和膽固醇的濃度及血漿胰島素。 口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）：在第24周時進(jìn)行實驗，測試胰島素敏感性。禁食12 h后給予2 g/kg BW葡萄糖灌胃，分別于給糖前和給糖后0、15、30、60和120 min采血，按照上述方法進(jìn)一步測量血糖和胰島素。 胰島素抵抗的評估：通過平衡模型評估（HOMA）進(jìn)行評估，HOMA用空腹血漿胰島素和空腹血漿葡萄糖濃度的數(shù)學(xué)方程進(jìn)行計算。 系統(tǒng)性炎癥的測定：血清中的LPS水平被用來表示HFD喂養(yǎng)的嚙齒動物的代謝性內(nèi)毒素血癥或系統(tǒng)性炎癥，通過LAL檢測進(jìn)行量化。 骨組織形態(tài)學(xué)微結(jié)構(gòu)分析：清除大鼠的右脛骨粘連肌、結(jié)締組織及骨髓，之后在70、95和100% v/v的乙醇中脫水3天，將骨樣嵌入甲基丙烯酸甲酯樹脂中，在42℃下培養(yǎng)2天，用裝有碳化鎢刀片的旋轉(zhuǎn)切片機(jī)對樹脂包埋的骨樣本進(jìn)行縱向切割，厚度分別為7 μm和12 μm，用于靜態(tài)和動態(tài)組織形態(tài)研究。靜態(tài)組織形態(tài)測量：7微米的切片被處理為Goldner三色染色，隨后在光鏡下觀察，獲得的參數(shù)包括按組織體積歸一化的骨小梁體積（骨體積分?jǐn)?shù)；BV/TV，%）、骨小梁厚度（Tb.Th，μm）、骨小梁數(shù)量（Tb.N，mm-1）、骨小梁分離度（Tb.Sp，μm）、按骨表面歸一化的成骨細(xì)胞表面（Ob.S/BS，%）、按骨表面歸一化的破骨細(xì)胞表面（Oc.S/BS，%），以及按骨表面歸一化的活性侵蝕表面（aES/BS，%）；動態(tài)組織形態(tài)測量：在熒光顯微鏡下確定12 μm未染色切片的鈣素標(biāo)記雙線，獲得的參數(shù)包括按骨面歸一化的雙標(biāo)記面（dLS/BS，%）、按骨面歸一化的礦化面（MS/BS，%）、礦物質(zhì)附著率（MAR，μm/day）和按骨面歸一化的骨形成率（BFR/BS，μm3·μm-2·day-1）。 試驗結(jié)果 （1）代謝參數(shù)和胰島素敏感性 由表1可知，HFD喂養(yǎng)大鼠的體重顯著高于ND喂養(yǎng)的大鼠；HFD喂養(yǎng)的大鼠血漿總膽固醇，特別是低密度脂蛋白升高；高胰島素血癥決定了HFD喂養(yǎng)大鼠的胰島素抵抗，但血糖水平?jīng)]有明顯變化，且觀察到HFD喂養(yǎng)大鼠的HOMA指數(shù)升高。
由表2可知，在研究結(jié)束時，經(jīng)載體處理的HFD大鼠的肥胖-胰島素抵抗仍持續(xù)存在；每天給這些大鼠服用益生菌、益生元和合生元，可使血漿總膽固醇、低密度脂蛋白、胰島素水平以及通過OGTT測定的胰島素敏感性恢復(fù)到載體處理的ND大鼠的水平；然而，與載體處理的HFD大鼠相比，這些治療只降低了HFD大鼠的體重和內(nèi)臟脂肪（P<0.05），所有的生物療法均未改變ND大鼠的代謝參數(shù)，我們的數(shù)據(jù)表明，生物療法減輕了HFD喂養(yǎng)大鼠的肥胖胰島素抵抗。  （2）全身性炎癥 由表1可知，與ND大鼠相比，12周的高脂飲食導(dǎo)致LPS水平顯著升高（P=0.001）；由表2可知，在24周時，與用載體處理的ND大鼠相比，用載體處理的HFD大鼠其LPS水平仍然較高（P<0.001）；盡管所有的生物處理都未影響ND大鼠的LPS水平，但與用載體處理的HFD大鼠相比，HFD大鼠的LPS水平顯著下降（P<0.001），這些研究結(jié)果表明，L. 副干酪乳桿菌HII01、XOS及其合生元能減少HFD大鼠的全身性炎癥。 （3）骨微結(jié)構(gòu)參數(shù) 如圖2所示，與其它所有組相比，在脛骨近端干骺端進(jìn)行Goldner三色染色的代表性組織學(xué)圖像顯示，經(jīng)載體處理的HFD大鼠的骨小梁更小、更??；如圖3和圖4所示，圖3A、3B顯示，與載體處理的ND大鼠相比，載體處理的HFD大鼠的骨體積分?jǐn)?shù)BV/TV和骨小梁厚度Tb.Th持續(xù)減少（P<0.05）；然而，圖3C、3D顯示，在載體處理的HFD大鼠中，沒有觀察到骨小梁分離度Tb.Sp和骨小梁數(shù)量Tb.N的顯著變化；圖3A、3B顯示，在ND大鼠中，給予副干酪乳桿菌HII01、XOS和合生元后沒有顯著的變化，但在HFD大鼠中，與載體處理的HFD大鼠相比，所有的治療方法都可以改善BV/TV和Tb.Th（P<0.05）。
（4）成骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞相關(guān)參數(shù) 如圖4A所示，各組之間的Ob.S/BS沒有任何顯著差異；但圖4B、4C顯示，經(jīng)載體處理的HFD大鼠的Oc.S/BS和aES/BS都有所增加（P<0.001）。補(bǔ)充副干酪乳桿菌HII01、XOS和合生元沒有改變ND喂養(yǎng)大鼠的任何骨細(xì)胞參數(shù)，盡管與載體處理的HFD喂養(yǎng)的大鼠相比，它們顯著減少了HFD大鼠的Oc.S/BS和aES/BS（P<0.01）；然而，圖4B、4C顯示，與載體處理的ND大鼠相比，這些生物處理的HFD大鼠仍有Oc.S/BS和aES/BS的升高（P<0.05）。
（5）動態(tài)骨組織形態(tài)測量 如圖5A所示，載體處理的HFD喂養(yǎng)的大鼠顯示出兩條綠色熒光線之間的距離最小，表明礦化活動最少，這些也與定量參數(shù)一致；圖5B-5E顯示，包括與載體處理的ND大鼠相比，在載體處理的HFD大鼠中dL.S/BS（按骨面歸一化的雙標(biāo)記面）、MS/BS（礦化表面）、MAR（礦物附著率）和BFR/BS（按骨面歸一化的骨形成率）顯著減少（P<0.05）；盡管所有的生物制劑對ND喂養(yǎng)的大鼠沒有影響，但在HFD喂養(yǎng)的大鼠中，這些生物制劑類似地增加了所有這些動態(tài)參數(shù)，這些發(fā)現(xiàn)表明，服用副干酪乳桿菌HII01、XOS和合生元可以提高HFD誘導(dǎo)的肥胖-胰島素抵抗大鼠的成骨細(xì)胞活性，從而增強(qiáng)骨形成。
試驗結(jié)論 總之，副干酪乳桿菌HII01、低聚木糖和合生元改善了高脂飲食喂養(yǎng)大鼠的肥胖-胰島素抵抗和全身性炎癥，這些生物制劑同樣增加了高脂飲食喂養(yǎng)大鼠的骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁厚度，減少了破骨細(xì)胞表面和活性侵蝕表面，增加了雙標(biāo)記面、礦化面、礦物附著率和骨形成率，綜上所述，這些生物制劑療法可能通過減輕破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和促進(jìn)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨形成來增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)大鼠的骨微結(jié)構(gòu)。 參考資料： Eaimworawuthikul S，Tunapong W，Chunchai T,et al.Lactobacillus paracasei HII01， xylooligosaccharide and synbiotics improve tibial microarchitecture in obese-insulin resistant rats[J].Journal of Functional Foods，2019，59371-379. |
