試驗(yàn)設(shè)計(jì) 小鼠的分組與處理：選擇5周齡C57/BL6J 雄性小鼠40只，于18~24℃光暗各12 h環(huán)境下飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂飼7 d后，隨機(jī)分為低脂飲食對(duì)照組（LFD組）、高脂飲食模型組（HFD組）、高脂飲食+低劑量XOS干預(yù)組（XOS.L組）、高脂飲食+高劑量XOS干預(yù)組（XOS.H組）4組，每組10只。LFD組和HFD組分別喂飼脂肪含量10%的低脂飼料和脂肪含量60%的高脂飼料，XOS.L組和XOS.H組小鼠在HFD組基礎(chǔ)上分別灌胃0.35和1.0 g/kg的XOS（將0.35 g和1.0 g的XOS分別溶于10 mL生理鹽水中），每日1次；LFD 組、HFD組小鼠灌胃等劑量生理鹽水，所有小鼠共灌胃16周，每日記錄小鼠進(jìn)食量，每日測(cè)量小鼠體質(zhì)量。 小鼠血生化指標(biāo)的檢測(cè)及肝臟的組織學(xué)評(píng)估：第16周時(shí)，小鼠禁飲食12 h后，腹腔麻醉，眼球取血，分離血清，使用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、三酰甘油（TG）含量。采血后斷頸處死小鼠，立即剝離出小鼠的肝臟組織；收集小鼠近段結(jié)腸內(nèi)的新鮮糞便，液氮冷凍后于冰箱-80℃保存，備用。各組小鼠分別取1/4肝臟組織，用4%多聚甲醛固定24 h之后，石蠟包埋后切片，洗脫石蠟后切片行蘇木素-伊紅（HE）染色；另取各組小鼠1/4肝臟組織于4%多聚甲醛固定24 h后，OCT包埋后切片，洗脫OCT后行油紅O染色。由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家對(duì)各組小鼠肝臟的 HE染色切片，通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照SAF評(píng)分系統(tǒng)。 16S rRNA基因測(cè)序和數(shù)據(jù)分析：取各組小鼠的新鮮糞便樣本，使用DNA抽提試劑盒提取糞便中的基因組DNA，以16S rRNA為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增靶向引物行PCR擴(kuò)增，使用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA濃度并將其純化后，通過上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司的Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。將所獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)，通過FLASH軟件進(jìn)行拼接、序列質(zhì)控后得到有效序列，使用Vsearch軟件將有效序列歸類為多個(gè)可操作分類單元（OTUs）。通過Muscle（versionv.1.30）軟件對(duì)各組基于OUTs結(jié)果的小鼠腸道菌群種類進(jìn)行α多樣性分析，獲得代表腸道菌群種類多樣性的Shannon指數(shù)，使用R語言工具繪制各組菌群種類多樣性的分布熱圖和箱式圖；通過多變量主坐標(biāo)分析（PCoA）對(duì)各組小鼠腸道菌群豐度的β多樣性進(jìn)行分析，即基于歐式距離算法和95%置信區(qū)間，來分析各組腸道菌群的距離尺度，得到橫坐標(biāo)（PC1）和縱坐標(biāo)（PC2）的PCoA圖。通過MetaStats分析各組小鼠腸道菌群在科水平和屬水平相對(duì)豐度，并進(jìn)行比較，獲得各組間差異較大的腸道菌群。 小鼠糞便代謝組學(xué)分析：取各組小鼠的新鮮糞便樣本，經(jīng)PBS預(yù)處理后，采用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（由Nexera UPLC超高效液相串聯(lián)QE高分辨質(zhì)譜儀組成）分析在ESI正離子和負(fù)離子模式下的糞便代謝譜。通過Proteo Wizard軟件把糞便代謝譜的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成 mzXML格式，然后應(yīng)用Progenesis QI v2.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將處理好的數(shù)據(jù)通過正交偏小二乘判別分析（OPLS-DA）模型來區(qū)分各組小鼠代謝譜的差異。為了驗(yàn)證該模型的可靠性，采用置換驗(yàn)證對(duì)其進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)。 差異代謝物獲取與通路富集分析：將從各組小鼠糞便中分析得到的糞便代謝譜數(shù)據(jù)，利用R語言中的Metabo Analyst R包，以P<0.05且VIP>1為篩選條件進(jìn)行代謝物差異分析。將獲得的差異代謝物導(dǎo)入Metabo Analyst 5.0 平臺(tái)，再使用KEGG Compound數(shù)據(jù)庫對(duì)差異代謝物進(jìn)行通路富集分析，比較差異代謝物在共同通路中的富集強(qiáng)度。采用 Speraman方法對(duì)各組小鼠的差異腸道菌群與差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，以獲得腸道菌群與代謝物之間的相互關(guān)系。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）各組小鼠血清指標(biāo)及肝臟組織學(xué)比較 由表1可知，單因素方差分析結(jié)果顯示，4組小鼠血清中ALT、AST、TG水平及肝臟SAF評(píng)分比較差異均有顯著性（F=39.17~113.80，P<0.05）。其中與LFD組比較，HFD 組血清ALT、AST、TG水平及SAF評(píng)分均顯著增高（t=8.26~15.68，P<0.05）；與HFD組比較，XOS.L組和 XOS.H組小鼠上述各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低（t=5.89~12.19，P<0.05）；XOS.H組較XOS.L組小鼠上述各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低（t=2.37~3.79，P<0.05）。
如圖1所示，肝臟組織切片HE染色顯示，LFD組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列較為整齊，肝索呈放射狀排列，無明顯纖維化；XOS.H組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝索排列尚整齊，輕度纖維化；XOS.L組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝索排列不齊，部分肝細(xì)胞氣球樣變，纖維化較XOS.H組重；HFD組小鼠肝臟損傷嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝細(xì)胞腫脹、肝索排列紊亂，有大量氣球樣變，明顯纖維化。油紅O染色顯示，LFD組肝臟組織切片幾乎無油紅著色，XOS.H組有輕微著色，XOS.L組著色較LFD組、XOS.H組深，但比HFD組輕，而HFD組小鼠肝臟內(nèi)著色均較余3組明顯。
（2）小鼠腸道菌群多樣性分析 如圖2A所示，α多樣性分析的結(jié)果顯示，LFD組、HFD組、XOS.L組、XOS.H組小鼠腸道菌群種類多樣性均未見顯著性差異（P>0.05），Shannon指數(shù)分別為5.81±0.94、6.07±0.85、6.13±0.61、6.25±0.37，各組間比較差異無顯著性（P>0.05）；同時(shí)通過Shannon指數(shù)所繪制的箱式圖也呈窄、扁形狀，見圖2A，說明各組Shannon指數(shù)值相對(duì)穩(wěn)定。 如圖2B所示，β多樣性分析的結(jié)果顯示，圖中4組腸道菌群豐度以4種不同的顏色的符號(hào)表示，以95%置信區(qū)間將各組腸道菌群豐度進(jìn)行聚類，顯示HFD組與LFD組、XOS.L組和XOS.H組橢圓重疊度均較低，說明HFD組與余3組的菌群豐度差異較大；LFD組、XOS.L組和XOS.H組橢圓重疊度較高，說明這3組菌群豐度差異較?。?/span>XOS.H組與LFD組橢圓重疊度最高，說明這兩組的腸道菌群豐度差異最小。
MetaStat分析結(jié)果顯示，在屬水平方面，4組小鼠中腸道菌群相對(duì)豐度均較高的屬分別為Bacteroides、Parabacteroides、Faecalibaculum、Alistipes、Colidextribacter、Oscillibacter、Coriobacteriaceae_UCG_00等。其中與LFD組相比較，HFD組Bacteroides、Parabacteroides等菌群豐度顯著降低（P<0.01），而Faecalibaculum、Alistipes、Colidextribacter、Oscillibacter等菌群的豐度顯著升高（P<0.05）；與 HFD組相比，XOS.H組Actinobacteria、Coriobacteriia、Coriobacteriaceae_UCG_002等菌群豐度顯著降低（P<0.05）；XOS.L組與其余三組比較，各菌群豐度差異不明顯（P>0.05）?？扑椒矫?，4組小鼠中腸道菌群相對(duì)豐度均較高的科分別為Lachnospiraceae、Prevotellaceae、Ruminococcaceae等。與LFD組相比，HFD組Ruminococcaceae、Erysipelatotrichaceae、Lachnospiraceae、Oscillospirace等菌群的豐度顯著升高（P<0.05），Bacteroidaceae、Muribaculaceae、Prevotellaceae等菌群的豐度顯著降低（P<0.05）；與HFD組相比，XOS.H組Ruminococcaceae、Atopobiaceae、Bacteroidaceae、Faecalibaculum、Erysipelatotrichaceae等菌群豐度顯著降低（P<0.05），Bifidobacterium、Alloprevotella、Prevotellaceae等菌群豐度顯著升高（P<0.01）；XOS.L組較其余的3組僅Fusobacterium、Erysipelatotrichaceae菌群的豐度顯著降低（P<0.05）。 （3）各組小鼠糞便差異代謝物分析 在OPLS-DA模型中，4組小鼠糞便差異代謝物的分布明顯分離，互不重疊，說明 OPLS-DA模型無過度擬合，穩(wěn)定性良好，對(duì)糞便代謝物差異性分析的評(píng)價(jià)結(jié)果可靠度高。同時(shí)對(duì)模型經(jīng)200次置換檢驗(yàn)后，顯示R2=0.97，Q2=-0.2，R2表示模型的擬合情況，其值接近1.0，證明模型的穩(wěn)定性好；Q2為模型的預(yù)測(cè)指數(shù)，其值為負(fù)值，證明模型的預(yù)測(cè)能力可靠。 對(duì)小鼠糞便代謝物分析顯示，HFD組與LFD組比較有117種上調(diào)，66種下調(diào)（VIP=1.0~2.0，P<0.05）；XOS.L組與HFD組比較有84種上調(diào)，77種下調(diào)（VIP=1.0~3.0，P<0.05）；XOS.H組與HFD組比較有247種上調(diào)，91種下調(diào)（VIP=1.0~1.5，P<0.05）；XOS.H組與XOS.L組比較有100種上調(diào)，15種下調(diào)（VIP=0.5~2.5，P<0.05）。各組間兩兩比較得到的最顯著的差異代謝物包括前列腺素H2（PGH2）、前列腺素D2（PGD2）、白三烯B4（LTB4）、△12-前列腺素J2（△12-PGJ2）、亞油酸（LA）、二十二碳五烯酸（DPA）等。 （4）各組差異代謝物 KEGG 通路富集分析 分析結(jié)果顯示，4組小鼠的差異代謝物在花生四烯酸代謝途徑、LA代謝途徑、不飽和脂肪酸代謝途徑中均發(fā)生顯著富集，其中，HFD組較LFD組△12-PGJ2、PGH2等差異代謝物富集強(qiáng)度顯著上調(diào)（P<0.001），PGD2等差異代謝物富集強(qiáng)度顯著下調(diào)（P<0.05），XOS.H組較HFD組的PGH2富集下調(diào)，而PGD2以及不飽和脂肪酸LA、DPA富集強(qiáng)度顯著上調(diào)（P<0.01），XOS.L組較HFD組僅DPA、PGD2的富集強(qiáng)度上調(diào)（P<0.01）。 （5）各組小鼠腸道菌群與差異代謝物相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，差異代謝物PGH2與Alistipes、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lactobacillus、Ileibacterium 等的豐度呈正相關(guān)性（P<0.01），同時(shí)與Lachnospiraceae_NK4A136_group、Allobaculum、Faecalibaculum 的 豐 度 呈 負(fù) 相 關(guān) 性（P<0.05）。PGD2與 Lachnospiraceae_NK4A136_group 的豐度呈正相關(guān)（P<0.05），而與Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lactobacillus、Ileibacterium 以及Alistipes的豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（P<0.01）。△12-PGJ2與Colidextribacter 的豐度呈正相關(guān)性（P<0.01），與 Bacteroides、Alloprevotella 豐度呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）。同時(shí)LA與Lachnospiraceae_NK4A136_group、Oscillibacter、Colidextribacter的豐度呈正相關(guān)（P<0.05），與Rikenellaceae_RC9_gut_group、Ileibacterium、Lactobacillus、[Eubacterium]_fissicatena_group的豐度呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。另外DPA與Lachnospiraceae_NK4A136_group的豐度呈正相關(guān)（P<0.001），而與Rikenellaceae_RC9_gut_group、Ileibacterium、Lactobacillus、Alistipes的豐度呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。 試驗(yàn)結(jié)論 本研究通過對(duì)高脂飲食致脂肪肝（FLD）模型小鼠的組織病理特征分析顯示，XOS的干預(yù)可顯著降低FLD小鼠血液中的ALT、AST、TG水平，改善肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴堆積及肝細(xì)胞水腫，顯著降低肝細(xì)胞損傷；對(duì)小鼠腸道菌群及代謝物的HEGG通路分析顯示，XOS可能通過花生四烯酸代謝、亞油酸代謝及不飽和脂肪酸代謝等途徑調(diào)節(jié)PGH2、PGD2、LA以及DPA等代謝物水平，進(jìn)而影響腸道菌群Lachnospiraceae_NK4A136_group、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lactobacillus、Ileibacterium等科到屬水平及其腸道代謝物的變化，從而改善FLD小鼠肝臟脂肪樣變，延緩肝損傷進(jìn)展。因此XOS作為益生元可能具有改善高脂飲食所致脂肪肝的效果。 參考資料： 李翰卿,李宇鹍,張震,等.低聚木糖對(duì)高脂飲食致脂肪肝小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志,2024,39(02):108-113+119. |
