試驗(yàn)設(shè)計(jì) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：使用6月齡的雄性APP/PS1小鼠，體重為20-25克。研究前，小鼠在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下（12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)，22±2℃，自由進(jìn)食和飲水）生活一周。小鼠被隨機(jī)分配到五組：對(duì)照組（Con）、麻醉組、手術(shù)組（S）、XOS組和XOS+手術(shù)組（XOS+S）。麻醉組的小鼠接受了0.5小時(shí)的七氟醚麻醉。S組和XOS+S組的小鼠接受了部分肝切除術(shù)加0.5小時(shí)七氟醚麻醉；XOS和XOS+S組的動(dòng)物在手術(shù)前五周和手術(shù)后一周用XOS灌胃（150微升/天，10%的XOS在PBS中，早上9點(diǎn)）；對(duì)照組、麻醉組和S組的小鼠用PBS灌胃喂食。在我們的初步實(shí)驗(yàn)中，六周的XOS干預(yù)對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能障礙和相關(guān)機(jī)制有保護(hù)作用。 麻醉和手術(shù)：麻醉組的小鼠在麻醉室接受新鮮空氣/氧氣中的2.5%（1.0 MAC）七氟醚麻醉，期間小鼠自主呼吸，并連續(xù)測(cè)量七氟醚濃度；最后，小鼠在充滿100%氧氣的室內(nèi)在保溫毯上恢復(fù)，直到它們醒來(lái)。S組和XOS+S組的小鼠在2.5%七氟烷麻醉下進(jìn)行了部分肝臟切除術(shù)，通過(guò)一個(gè)2厘米的上腹部中線切口暴露肝臟，肝臟的左側(cè)葉被切除，然后用5-0縫合切口，用碘伏消毒三次，然后用0.25%布比卡因浸潤(rùn)。手術(shù)后，小鼠在含有100%氧氣的室內(nèi)，在保溫毯上進(jìn)行恢復(fù)，每隔8小時(shí)在切口上涂抹一次鹽酸利多卡因凝膠，直到術(shù)后2天。Con組的小鼠沒(méi)有接受任何治療。術(shù)后兩天進(jìn)行微生物群分析、行為測(cè)試、肝功能和葡萄糖水平的測(cè)量，四個(gè)組之間的肝功能和葡萄糖水平?jīng)]有明顯差異（表1）。
Morris水迷宮試驗(yàn)：用Morris水迷宮試驗(yàn)評(píng)估空間記憶；水池被平均分成四個(gè)部分。小鼠面向水箱壁，從第一區(qū)到第四區(qū)依次放入水中，間隔時(shí)間為10分鐘。在所有的試驗(yàn)中，小鼠被允許游泳，直到它們爬上隱藏的平臺(tái)。如果小鼠在90秒內(nèi)沒(méi)有找到平臺(tái)，它將被引導(dǎo)到平臺(tái)上，并在那里停留30秒。小鼠在手術(shù)前5天和手術(shù)后7天內(nèi)每天接受測(cè)試。在手術(shù)后的第3天和第7天，進(jìn)行探針試驗(yàn)（在平臺(tái)被移除后，允許小鼠游泳90秒），記錄穿越平臺(tái)區(qū)域的時(shí)間，并將其作為記憶功能的一個(gè)指標(biāo)；水溫保持在20-22℃，所有測(cè)試都在下午1點(diǎn)至4點(diǎn)之間完成。 手術(shù)后兩天，直接從小鼠肛門(mén)口收集新鮮的糞便顆粒，立即用液氮冷凍，儲(chǔ)存在-80°C進(jìn)行糞便樣本DNA提取、PCR擴(kuò)增、測(cè)序和生物信息學(xué)分析，并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；對(duì)小鼠海馬體組織進(jìn)行裂解，測(cè)量上清液中的蛋白質(zhì)含量，進(jìn)行西方印跡分析、ELISA檢測(cè)，對(duì)收集的上清液進(jìn)行IL-1β、IL6、TNF-α和IL-10分析；使用免疫熒光法確定內(nèi)源性Iba-1蛋白在海馬CA1區(qū)和齒狀回（DG）的表達(dá)水平，對(duì)海馬CA1區(qū)切片進(jìn)行透射電子顯微鏡檢查。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）手術(shù)加麻醉，而不是單獨(dú)麻醉，損害了APP/PS1小鼠的空間記憶 如圖1A所示，與Con組相比，S組的小鼠在術(shù)后第2天和第3天的逃逸潛伏期顯著增加（P<0.05）；圖1C和圖1D顯示，與Con組相比，S組小鼠在術(shù)后第3天的平臺(tái)穿越次數(shù)明顯減少（P<0.05）；圖1A和圖1C顯示，單純七氟醚麻醉對(duì)水迷宮試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有明顯影響（P>0.05）；圖1B顯示，在訓(xùn)練和探針測(cè)試中，三組之間的游泳速度沒(méi)有顯著差異（p>0.05），這排除了干預(yù)后運(yùn)動(dòng)和知覺(jué)能力對(duì)空間記憶的影響，這些結(jié)果表明，手術(shù)，而不是麻醉，損害了APP/PS1小鼠的空間記憶。
（2）XOS干預(yù)減輕了手術(shù)誘發(fā)的APP/PS1小鼠的空間記憶缺失 如圖2A所示，與Con組相比，S組的小鼠在術(shù)后第2天和第3天的逃逸潛伏期顯著增加（P<0.05）；圖2C顯示，與Con組相比，S組小鼠在術(shù)后第3天的平臺(tái)穿越次數(shù)顯著減少（P<0.05）；圖2A和圖2C顯示，XOS干預(yù)扭轉(zhuǎn)了術(shù)后第3天平臺(tái)穿越次數(shù)的減少以及術(shù)后第2天和第3天逃逸潛伏期的增加（P<0.05），然而，Con組和XOS組在逃逸潛伏期和平臺(tái)穿越方面沒(méi)有顯著差異（P>0.05）；圖2B顯示，四個(gè)組在訓(xùn)練和逃逸潛伏期測(cè)試中的游泳速度是相當(dāng)?shù)模?/span>p>0.05），這些數(shù)據(jù)表明，XOS可以減弱手術(shù)引起的空間記憶障礙。
（3）XOS干預(yù)減輕了手術(shù)引起的腸道微生物群的改變 如圖3A和圖3B所示，共篩選出46個(gè)分類群，線性判別分析的閾值得分為2。Con組中豐度較高的分類群主要屬于變形菌門(mén)和放線菌門(mén)，Deltaproteobacteria和放線菌綱，雙歧桿菌目，Desulfo-vibrionales和Coriobacteriales，屬如Desulfovibrio，Dubosiella和雙歧桿菌；S組中豐度較高的類群主要屬于放線菌門(mén)、放線菌綱、紅蝽菌目、疣微菌科和Eggerthellaceae科，屬如放線菌屬和疣微菌科_UCG_014；在XOS+S組中豐度較高的分類群主要屬于Melainabacteria綱，Gastranaerophilales目，普雷沃氏菌科，Alloprevotella屬，A2和疣微菌科_UCG_014；XOS組中豐度較高的分類群主要屬于Muribaculaceae科和未分類的擬桿菌目，Faecalibaculum和Gordonibacter屬。
如圖3C所示，主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示，S組的腸道細(xì)菌組成與Con組有區(qū)別，XOS+S組與S組有區(qū)別，但XOS組與Con組沒(méi)有明顯區(qū)別；此外，我們發(fā)現(xiàn)有8個(gè)分類群在4個(gè)組之間有明顯的變化；圖4A-C顯示，與Con組相比，S組有三個(gè)屬（Rodentibacter、擬桿菌、Ruminococcaceae_UCG_ 014）明顯增加（P<0.05），XOS干預(yù)減輕了S組中增加的菌屬（p<0.05），但在對(duì)照條件下沒(méi)有（p>0.05）；圖4D顯示，與對(duì)照組相比，S組的一個(gè)屬（Faecalibaculum）明顯減少（P<0.05），且XOS干預(yù)明顯減弱了S組中該屬的減少（p<0.05），但在對(duì)照條件下沒(méi)有（p>0.05）；圖4E和圖4F顯示，與S組相比，XOS+S組兩種屬(Muribaculum和Lactobacillus)顯著增加(p<0.05)，但在S組和Con組之間或XOS組和Con組之間沒(méi)有明顯差異（p>0.05）；圖4G顯示，與Con組相比，S組有一個(gè)科（Eggerthellaceae）明顯增加（P<0.05），XOS干預(yù)后顯著降低了術(shù)后該科的增加（p<0.05）；圖4H顯示，S組與Con組相比，有一個(gè)科（Muribaculaceae）明顯減少（P<0.05），且XOS干預(yù)后明顯減弱了術(shù)后該科的減少（P<0.05）。 總之，這些數(shù)據(jù)表明，手術(shù)改變了腸道微生物群的組成和豐度，而XOS可以調(diào)節(jié)手術(shù)引起的微生物群的變化，此外，腸道微生物群的改變可能與手術(shù)誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙有關(guān)。
（4）XOS干預(yù)減輕了手術(shù)引起的腸道炎癥和屏障完整性損傷 如圖5A所示，與Con組相比，S組小鼠結(jié)腸中的促炎介質(zhì)IL-1β、IL-6和免疫抑制介質(zhì)IL-10明顯增加（P<0.05），XOS干預(yù)改善了手術(shù)后IL-1β、IL-6和IL-10表達(dá)的增加（p<0.05），但在對(duì)照組中沒(méi)有改善（p>0.05），然而，促炎介質(zhì)TNF-α在4組中沒(méi)有變化（p>0.05）。 如圖5B和圖5C所示，與Con組相比，S組的緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)明顯下降（p<0.05），而XOS干預(yù)增加了手術(shù)后ZO-1和Occludin的表達(dá)（p<0.05），但在對(duì)照條件下沒(méi)有增加（p>0.05），然而，Claudin-5在四組中沒(méi)有明顯差異（p>0.05），這些結(jié)果表明，手術(shù)可能誘發(fā)腸道炎癥反應(yīng)和腸道屏障完整性的破壞，而XOS調(diào)節(jié)了腸道微生物群，緩解了手術(shù)引起的腸道屏障損傷和炎癥反應(yīng)。
（5）XOS干預(yù)減弱了手術(shù)誘發(fā)的BBB損傷 如圖6所示，與Con組相比，S組的緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)顯著下降（P<0.05），XOS干預(yù)增加了術(shù)后ZO-1和Occludin的表達(dá)（p<0.05），但在對(duì)照組中沒(méi)有（p>0.05）；圖6B和圖6C顯示，4組海馬體中Claudin-5的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。 如圖6C所示，Con組小鼠基底層的超微結(jié)構(gòu)是連續(xù)和完整的，緊密連接和內(nèi)皮細(xì)胞是正常的；S組的小鼠在術(shù)后第2天出現(xiàn)BBB超微結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為局部基底層塌陷，緊密連接處開(kāi)放；XOS干預(yù)改善了手術(shù)后的BBB損傷，包括基底層的塌陷和開(kāi)放的緊密連接，此外，XOS組和Con組之間沒(méi)有明顯的超微結(jié)構(gòu)差異。
（6）XOS干預(yù)減輕了手術(shù)誘發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng) 如圖7A所示，與Con組相比，S組小鼠海馬體中IL-1β、IL-6和IL-10的水平顯著增加（P<0.05），XOS干預(yù)減輕了手術(shù)后IL-1β、IL6和IL-10水平的增加（p<0.05），但在對(duì)照條件下沒(méi)有減輕（p>0.05），TNF-α的水平在四組中沒(méi)有變化（p>0.05）。 如圖7B和圖7C所示，與Con組相比，S組海馬體CA1亞區(qū)和DG的Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加（P<0.05），XOS干預(yù)減輕了手術(shù)后Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞的增加（p<0.05），但在對(duì)照條件下沒(méi)有此影響（p>0.05）；圖7D顯示，與Con組相比，S組的Iba-1表達(dá)明顯增加（P<0.05），XOS干預(yù)減輕了術(shù)后Iba-1表達(dá)的增加（p<0.05），但在對(duì)照條件下沒(méi)有減輕（p>0.05）。 如圖7E所示，與Con組相比，S組TREM2的表達(dá)顯著下降（P<0.05），XOS干預(yù)增加了術(shù)后TREM2的表達(dá)（p<0.05），但在對(duì)照條件下卻沒(méi)有此影響（p>0.05）。 這些結(jié)果表明，手術(shù)增加了IL-1β、IL-6和IL-10的表達(dá)，降低了TREM2的表達(dá)和促進(jìn)了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，而TREM2的表達(dá)變化可能是該過(guò)程中小膠質(zhì)細(xì)胞激活的上游機(jī)制；此外，XOS干預(yù)可以減弱這些過(guò)程，這表明神經(jīng)炎癥反應(yīng)依賴于腸道微生物群的改變。
試驗(yàn)結(jié)論 在本研究中，研究了腸道微生物群在術(shù)后認(rèn)知功能障礙的病理生理過(guò)程中的潛在作用，結(jié)果表明，手術(shù)刺激與麻醉，而不是單獨(dú)麻醉，會(huì)誘發(fā)APP/PS1小鼠的空間記憶障礙；此外，手術(shù)改變了腸道微生物群，破壞了腸道屏障和BBB的完整性，并引發(fā)了外周和中樞炎癥反應(yīng)，而XOS干預(yù)可以穩(wěn)定腸道微生物群，改善腸道屏障和BBB的完整性，并防止外圍炎癥介質(zhì)滲入海馬體，因此XOS干預(yù)可能是預(yù)防術(shù)后認(rèn)知功能障礙的一種潛在方法。 參考資料： Prebiotics Regulation of Intestinal Microbiota Attenuates Cognitive Dysfunction Induced by Surgery Stimulation in APP/PS1 Mice.[J].Aging and disease,2020,11(5):1029-1045. |
